案例一

&Q 之前在你们那边做过一个转基因果蝇品系,该品系转的是276b-Gal4基因,所用的质粒为前期从你们那边拿回来的pVAM定点插入质粒,所插入的染色体为二号染色体,虫子拿回来之后,我做杂交发现了一个问题,该品系与野生型果蝇W1118杂交后F1代出现了白眼,而若是转基因成功的话应该是浅红眼而非白眼,后面我又提该品系果蝇的基因组做了一个所转基因Gal4的PCR检测,却检测到了GAL4基因,表明转基因是成功的,这两个检测的结论出现了矛盾。为什么转基因成功了,二号染色体上却并没有携带红眼基因Vermilion?下面附的是杂交方法图片。

4-1.png

&A vermilionwhite虽然都控制眼色,但是却是两个不同的基因,而且white是上位基因(epistatic)。你的杂交方案所有的F1代雄蝇应该都是白眼,雌蝇应该都是深红眼。你还要注意w1118带的是野生型的vermilion,而且这个转基因带的是野生型的white,所以在使用这个转基因果蝇的时候要考虑到这两点。

案例二

Q1 关于您组提供的一些RNAi品系,我想反映一点问题。
我订购的一些品系,订购的瓶子上都标记的是attp2,也就是定位在III号染色体,但是,我用这些品系的male果蝇分别与w1118处女蝇杂交后,都出现眼色雌雄分离的现象(♀都是红眼,♂都是白眼),根据眼色来判断,那么pUAST是插在X染色体上的。所以我的问题是:
1. 您那边用的质粒是pUAST-attb带有white gene marker吗?眼色能否作为pUAST插入的marker?
2.微注射的F0代与平衡子单杂的子代,是否挑选那些去掉了转座酶的子代,如果杂交时没注意这一点,那么转座酶的残留就会导致转座子任意跳出插入。
暂时就是有这些疑惑,期待您的解答。

A1 我们这些品系shRNA都是插到3号染色体上的,以vermilion+为标记,而其X染色体是w+v-的。所以与w1118雌蝇交配后代眼色不同。
我们不是使用的转座子插入shRNA的,我们是使用phiC31重组酶将质粒插入attP位点的,phiC31重组酶转基因位于X染色体,已经通过交配去掉了。但是请注意attP位点本身原来是用转座子插入基因组的,所以不要与有转座酶活性的品系杂交。

Q2 还有一点问题,
1. 某个品系,为什么带了两个染色体的平衡子:sco,sb?如果是shRNA在III号染色体的话,是不是只带sb平衡子就可以了?
2. 分析了一下,还是有点疑惑,转座酶位于X染色体,并且通过杂交去除,也就是X染色体的W+的marker也同时被去除?那为什么还会出现红眼?或者说这些shRNA品系 X染色体的w+是怎么来的?不知是否方便把你们注射后的杂交方案提供一下?

A2 可能我上一封邮件没有说清楚。这个品系的基因型大致上是y-,v-,sc-,w+;;[shRNA]y+v+/TM3,Sb 您看到的sc表型不是二号上的Sco显性突变,而是X染色体上的sc纯合隐性突变。这株果蝇只带TM3一个平衡子。
另外,我们构建这些果蝇的时候没有用到转座酶,是用的phiC31重组酶。这个重组酶转基因不带w+的marker。红眼是由于white基因本身是野生型的,而且这些RNAi品系眼色是野生型才是正常的情况。

Q3 RNAi品系带的vermilion+标记,这个标记的纯合或杂合眼色是什么颜色?我没有用过这个标记。
我用y-,v-,sc-,w+;;[shRNA]y+v+/TM3,Sbw1118杂交后,发现不带Sb平衡子的子代male蝇眼色几乎是白色的,看不到任何颜色,但理论上来看,它应该呈现vermilion的眼色。难道这个marker是个隐性的标记?

A3 vermilion-是隐性的,纯合突变是朱砂眼,也就是浅红色。补回vermilion+后是野生型的深红色。white对vermilion是上位基因,后代雄蝇由于是带w1118的X染色体,所以是白眼。

Q4 y-,v-,sc-,w+;;[shRNA]y+v+/TM3,Sb X w1118的子代雄蝇基因型是:y-,w-/Y;;[shRNA]y+v+/+, 其中有v+/+,它不能表现出浅红色的眼色?
那我们把这些RNAi品系与gal4杂交,就不用care眼色了,只要挑选不带平衡子的子代就行了?对吗?

A4 white基因对vermilion是上位的,所以它不能表现出浅红眼。
是的,对这个品系只要不带TM3平衡子就行。其它不带平衡子的品系直接杂交就可以了。

案例三

Q1 关于在贵处订的果蝇,我有一个疑问,希望你能指点一下,就是:
插入位点是3号染色体的果蝇,有的上面带有TM3,Sb的标记,我知道TM3是3号上的balancer,表型是短刚毛,但Sb是什么标记呢?是marker还是balancer?带在几号染色体上?表型是什么?是否和TM3连锁在一起?

A1 我们有一些转基因RNAi果蝇是纯合致死的,所以用TM3这个balancer平衡。Sb指的就是短刚毛,TM3 balancer很多是带Sb这个marker的。Sb是显性突变,同时是纯合致死的。另外,我们部分的RNAi果蝇品系在X染色体上带有sc隐性突变,背板无刚毛,请注意与Sb的表型区分。

Q2 我订了同一个基因的三个果蝇品系ABC,发现这三个果蝇的表型差异很大(并没有用gal4驱动),我想知道:都是定点插入的line,为什么差别会这么大?是插入位点不一样还是拷贝数不一样?同时我想知道attp2和attp40的插入位点是什么?只有一个位点还是有很多个?
另外再问一个我疑惑的很久的问题,用pUAST做转基因果蝇的时候,因为pUAST上带有一个红眼的标记,所以可以通过眼睛的颜色来判断是否插入成功。我注意到你们的载体是没有带标记的,那你们怎么检验自己的RNAi果蝇是已经定点插入成功的呢?
还有一个问题,有什么3号上的balancer,能在larvae期识别出来的(TM6B不算,因为我觉得比较难认)?

A2 这三个品系表型差异大主要是因为使用的小hairpin靶点不一样。另外我们也发现现在用的RNAi载体有basal level的表达。这样即使没有配Gal4,也会有微量的hairpin表达。大多数的情况下这种微量的表达是没有问题的。但看来你研究的这个基因刚好碰到这种微量hairpin表达也有部分敲除效应的情况。attp2和attp40两个插入位点分别在3号和2号染色体上,而且都是只有一个插入位点。倪老师之前发表的nature methods里有提到。
我们的RNAi载体是用vermilion+标记的,这样从朱砂色突变眼的果蝇中可以挑出野生型眼色的成功插入。
TM6B在2龄3龄larvae期已经算是好认的了。另外常用的有所谓green balancer等,是用荧光标记的,理论上embryo期都可以看到。但如果你们没有带荧光的体视镜也没法用。我之前用过一个CyO,Kr-GFP的,没有想像的好用。另外这些品系可能要到Bloomington订,我们这里也许只有Jose老师有一些,我可以帮你问一下。不过你可以上Bloomington网上先查一下。
那个RNAi载体有微量表达的情况对你的实验结果理论上应该没有影响。你应该可以配上Gal4后先观察这三株的表型,另外看看它们表型差异是不是很大。

Q3 关于三株果蝇,我又有一个问题,通过Real Time qPCR检测,我发现A株的目标基因呈过表达状态(对照为attp2 Trip control 36303),Elav>2516:Elav>36303约为2(取头部),Da>2516:Da>36303约为4(取全身),而B株和C株都为RNAi状态,因而我想问一下,贵处的RNAi果蝇出现overexpression是否属正常现象,还是我的检查方法有误?A株是RNAi还是overexpression?

A3 A株用的是long dsRNA敲除目标基因,而另两个用的是shRNA。你的qPCR引物要是刚好在long dsRNA内部就有问题了。其实还是抗体染色看蛋白质变化比较可靠。

Q4 关于A株的问题,按照你的提示,我用UCSC的Blat进行比对,证实了我的QPCR引物确实落在了long dsRNA内部,但当我在比对B株和C株的shRNA序列时,发现不仅可以找出目标基因Unr,还可以找出一个无关基因mir-1 (2L:20,487,441..20,487,531 ),对此我十分疑惑,由于此信息对我的实验影响比较大,希望你能帮忙解答~

A4 这应该是因为我们的hairpin是基于mir-1来设计的,以保证shRNA表达的稳定性。

Q5 那mir-1会被干扰吗?因为我注意到果蝇出现的表型与flybase上mir-1基因报道的表型比较类似,不知你们是否可以排除mir-1被干扰的情况?

A5 mir-1不会被干扰,因为mir-1的21个nt已经被替换了。我们实际上用的是mir-1的scaffold。